Цитологическая диагностика заболеваний шейки матки

Цитологическое исследование мазков из шейки матки позволяет оценить состояние слизистой оболочки, наличие или отсутствие признаков патологических процессов (реактивных, предопухолевых, опухолей). При выявлении другими лабораторными методами инфекционного агента (вирус папилломы человека, бактериальные и паразитарные инфекции), цитологический метод позволяет оценить реакцию организма на инфекционный агент, наличие или отсутствие признаков повреждения, пролиферации, метаплазии или трансформации эпителия. Возможно также при исследовании мазка определить причину изменений эпителия (наличие воспаления с ориентировочным или уверенным определением патогенной микробиоты (микрофлоры), патологических процессов, связанных с гормональным, лекарственным, механическим, лучевым воздействием на организм женщины и шейку матки, состояний, чреватых опасностью возникновения дисплазии и рака шейки матки, а при их развитии установить правильный диагноз. В связи с этим цитологическое исследование применяют как при скрининге (мазки с визуально нормальной шейки матки), так и при наличии видимых при гинекологическом осмотре изменений слизистой оболочки.

Получение материала

Рак шейки матки чаще всего развивается в зоне трансформации, ему предшествуют фоновые процессы и внутриэпителиальные поражения (дисплазия эпителия), которые могут располагаться на небольших участках, поэтому важно, чтобы материал был получен со всей поверхности шейки матки, особенно из зоны стыка плоского и цилиндрического эпителия. Число измененных клеток в мазке бывает различным, и если их мало, то увеличивается вероятность, что патологические изменения могут быть пропущены при просмотре препарата. Для эффективного цитологического исследования необходимо учитывать:

• при профилактических осмотрах цитологические мазки следует брать у женщин независимо от жалоб, наличия или отсутствия изменений слизистой оболочки. Цитологическое исследование следует повторять не реже, чем раз в три года;
• желательно получать мазки не ранее, чем на 5-е сутки менструального цикла и не позднее, чем за 5 суток до предполагаемого начала менструации;
• нельзя брать материал в течение 48 ч после полового контакта, использования любрикантов, раствора уксуса или Люголя, тампонов или спермицидов, спринцевания, введения во влагалище медикаментов, свечей, кремов, в т. ч. кремов для выполнения ультразвукового исследования;
• беременность – не лучшее время для скрининга, так как возможны неправильные результаты, но, если нет уверенности, что женщина придет на обследование после родов, лучше мазки взять;
• при симптомах острой инфекции желательно получать мазки с целью обследования и выявления патологических изменений эпителия, этиологического агента; также необходим цитологический контроль после лечения, но не ранее, чем через 2 мес. после окончания курса.

Материал из шейки матки должен брать врач-гинеколог или (при скрининге, профилактическом осмотре) хорошо обученная медицинская сестра (акушерка).

Важно, чтобы в мазок попадал материал из зоны трансформации, так как около 90% опухолей исходит из зоны стыка плоского и цилиндрического эпителия и зоны трансформации и только 10% из цилиндрического эпителия цервикального канала.

С диагностической целью материал получают раздельно из эктоцервикса (влагалищной порции шейки матки) и эндоцервикса (цервикального канала) с помощью шпателя и специальной щетки (типа Cytobrush). При проведении профилактического осмотра используют Cervex-Brush, различные модификации шпателя Эйра и другие приспособления для получения материала одновременно из влагалищной части шейки матки, зоны стыка (трансформации) и цервикального канала.

Перед получением материала шейку матки обнажают в “зеркалах”, дополнительных манипуляций не проводят (шейку не смазывают, слизь не удаляют; если слизи много – ее аккуратно снимают ватным тампоном, не надавливая на шейку матки.). Щетку (шпатель Эйра) вводят в наружный зев шейки матки, осторожно направляя центральную часть приспособления по оси цервикального канала. Далее ее наконечник поворачивают на 360° (по часовой стрелке), достигая тем самым получения достаточного числа клеток из эктоцервикса и из зоны трансформации. Введение инструмента выполняют очень бережно, стараясь не повредить шейку матки. Затем щетку (шпатель) выводят из канала.

Что значит мазок на цитологию?

Цитология – это безболезненный и полностью безопасный тест, который занимает немного времени. Забор материала для исследования производится в гинекологическом кабинете.

Цитологическое исследование соскобов шейки матки, цервикального канала, влагалища с окраской по Папаниколау в Москве от 2 -х дней

от 250 ₽

Записаться

Цитологическое исследование материала, полученного при раздельном диагностическом выскабливании в Москве от 2 р.д.

от 600 ₽

Записаться

Цитологическое исследование мазков с поверхности шейки матки и цервикального канала в Москве от 3 р.д.

от 1850 ₽

Записаться

Пациентка усаживается на кресло, после чего доктор при помощи зеркала и специальной щетки производит забор эпителиальных клеток шейки матки. Материал переносится на стекло, окрашивается и рассматривается код микроскопом.

О частоте прохождения данной процедуры четких рекомендаций нет. Большая часть специалистов утверждают, что мазок желательно сдавать ежегодно, начиная с возраста в 18 лет. Некоторые гинекологи говорят, что исследование нужно проводить каждые 3 года женщинам старше 25 лет. Есть еще ряд гинекологов, которые утверждают, что тест можно проводить раз в 5 лет при условии, что предыдущие анализы были хорошими.

Тест необходимо проводить и тем женщинам, у которых еще не было полового акта. Дело в наследственности онкологических заболеваний. Конечно, большая часть случаев онкологии связана с вирусом папилломы человека, который зачастую передается во время полового контакта. Поэтому риск возникновения рака шейки матки у девственницы небольшой, но он все же есть. Отказываться от прохождения процедуры не следует.

При помощи исследования можно выявить предраковое состояние на ранней стадии, еще до того момента, когда у женщины проявятся какие-либо симптомы.

Также цитологическое исследование применяется и для определения других патологий шейки матки, например, эрозии и воспаления. Кроме того, данный анализ показывает и наличие вируса папилломы человека. Именно он является главным фактором возникновения онкологии, хотя тип вируса определяется лишь при помощи генетического анализа.

Приготовление препаратов

Перенос образца на предметное стекло (традиционный мазок) должен происходить быстро, без подсушивания и потери прилипших к инструменту слизи и клеток. Обязательно перенести на стекло материал с обеих сторон шпателя или щетки.

Если предполагается приготовление тонкослойного препарата с помощью метода жидкостной цитологии, головку щетки отсоединяют от ручки и помещают в контейнер со стабилизирующим раствором.

Фиксация мазков

выполняется в зависимости от предполагаемого метода окрашивания.

Окрашивание по Папаниколау и гематоксилин-эозином наиболее информативны в оценке изменений эпителия шейки матки; любая модификация метода Романовского несколько уступает этим методам, однако при наличии опыта позволяет правильно оценить и характер патологических процессов в эпителии и микрофлору.

Клеточный состав мазков представлен слущенными клетками, находящимися на поверхности эпителиального пласта. При адекватном получении материала с поверхности слизистой оболочки шейки матки и из цервикального канала в мазок попадают клетки влагалищной порции шейки матки (многослойный плоский неороговевающий эпителий), зоны стыка или трансформации (цилиндрический и, при наличии плоскоклеточной метаплазии, метаплазированный эпителий) и клетки цервикального канала (цилиндрический эпителий). Условно клетки многослойного плоского неороговевающего эпителия принято делить на четыре типа: поверхностные, промежуточные, парабазальные, базальные. Чем лучше выражена способность эпителия к созреванию, тем более зрелые клетки попадают в мазок. При атрофических изменениях на поверхности эпителиального пласта расположены менее зрелые клетки.

Виды тестов

Сейчас применяется два способа исследования. Главным отличием между ними является разная эффективность.

ПАП-тест

ПАП-тест – это процедура исследования биологического материала, взятого с наружного маточного зева и непосредственно из шейки матки. Материал окрашивается по способу, разработанному Папаниколау. При соблюдении методики проведения анализа ПАП-тест имеет высокие показатели достоверности. С его помощью можно обнаружить предраковые состояния и атипичные клетки во взятом материале.

Зачастую исследуют биологический материал, который был получен с использованием специальной цитощетки и зафиксирован на стекле спиртом.

Такое исследование, кроме предраковых состояний, определяет наличие инфекции.

Жидкостная цитология

Жидкостная цитология – относительно новый способ диагностики онкологии шейки матки. Основное отличие этого анализа от традиционного заключается в том, что при жидкостной цитологии сбор биоматериала производится на жидкой основе. Его не переносят на стекло и не размазывают.

Уже многократно доказано, что жидкостная цитология гораздо точнее и чувствительнее, чем ПАП-тест. Основным преимуществом жидкостного способа является то, что он позволяет собрать намного больше клеток для дальнейшего микроскопического анализа. К тому же метод предполагает использование этого же материала и для других тестов, например, генетического тестирования вируса папилломы человека.

Интерпретация результатов цитологического исследования

Наиболее распространенная в настоящее время – классификация Bethesda (The Bethesda System), разработанная в США в 1988 г, в которую вносили несколько изменений. Классификация создана для более эффективной передачи информации из лаборатории врачам клинических специальностей и обеспечения стандартизации лечения диагностированных нарушений, а также последующего наблюдения за больными.

В классификации Bethesda выделяют плоскоклеточные интраэпителиальные поражения низкой и высокой степени (squamous intraepithelial lesions of low grade and high grade – LSIL и HSIL) и инвазивный рак. Плоскоклеточные интраэпителиальные поражения низкой степени включают изменения, связанные с папилломавирусной инфекцией и слабой дисплазией (CIN I), высокой степени – умеренную дисплазию (CIN II), тяжелую дисплазию (CIN III) и внутриэпителиальный рак (cr in situ). В этой классификации имеются также указания на специфические инфекционные агенты, вызывающие заболевания, передавае мые половым путем.

Для обозначения клеточных изменений, которые трудно дифференцировать между реактивными состояниями и дисплазией предложен термин ASCUS – atypical squamous cells of undetermined significance (клетки плоского эпителия с атипией неясного значения). Для клинициста этот термин мало информативен, однако он нацеливает врача на то, что данная пациентка нуждается в обследовании и/или в динамическом наблюдении. В классификацию Bethesda в настоящее время введен также термин NILM – no intraepithelial lesion or malignancy, объединяющий норму, доброкачественные изменения, реактивные изменения.

Так как данные классификации используются в практике врача-цитолога, ниже приведены параллели между классификацией Bethesda и классификацией, распространенной в России (Табл. 22). Цитологическое стандартизованное заключениепо материалу из шейки матки (форма № 446/у), утверждено приказом Минздрава России от 24.04.2003 № 174.

Причины получения неполноценного материала различны, поэтому цитолог перечисляет типы клеток, обнаруженные в мазках и по возможности указывает причину, по которой материал признан неполноценным.
Цитологические изменения в железистом эпителии

* при возможности ASCUS должны быть определены как сходные с реактивными, репаративными или предраковыми процессами;

** изменения, связанные с воздействием вируса папилломы человека, ранее обозначаемые как койлоцитоз, койлоцитарная атипия, кондиломатозная атипия, включены в категорию слабо выраженных изменений клеток плоского эпителия;

*** по возможности следует отметить, относятся ли изменения к CIN II, CIN III, есть ли признаки cr in situ;

**** гормональная оценка (проводится только по вагинальным мазкам): – гормональный тип мазка соответствует возрасту и клиническим данным; – гормональный тип мазка не соответствует возрасту и клиническим данным: (расшифровать); – гормональная оценка невозможна в связи с: (указать причину).

Кому показано исследование?

Цитология шейки матки необходима в том случае, если:

1. Женщина планирует забеременеть.
2. Роды происходили несколько раз подряд (к примеру, 3 раза за 4–5 лет).
3. Первый раз женщина рожала в раннем возрасте.
4. Частая смена сексуальных партнеров.
5. Планируется установка спирали.
6. Долгое время не проводилось цитологическое исследование либо его вовсе никогда не было.
7. Результаты последнего исследования плохие.
8. Обнаружены заболевания, связанные с вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ).
9. Кто-то из родственников болел онкологическими заболеваниями, то есть семейный анамнез отягощен.

В целом каждой женщине желательно каждый год проходить скрининговое цитологическое обследование. Если есть выраженные отклонения от нормы, то процедуру нужно проходить каждые 6 месяцев.

Также есть и противопоказания к проведению исследования:

1. Активный воспалительный процесс во влагалище и непосредственно на шейке матки.
2. Менструация.

Хоть эта процедура полностью безвредна и безболезненна, её не рекомендуется проводить при наличии данных факторов. Во время воспаления или при инфекции увеличивается количество лейкоцитов, что может сильно повлиять на точность результатов.

Интеграция различных лабораторных методов

В диагностике заболеваний шейки матки важное значение имеют клинические данные, результаты исследования на микрофлору (классические микробиологические (культуральные), методы АНК (ПЦР, RT-PCR, Hybrid Capture, NASBA, и др.).

При необходимости уточнения патологического процесса (ASC-US, ASC-H) цитологическое исследование по возможности дополняют молекулярно биологическими (p16, онкогены, метилированная ДНК и др.).

Исследования для обнаружения ВПЧ имеют низкую прогностическую значимость, особенно у молодых женщин (до 30 лет), в связи с тем, что у большинства пациенток этой возрастной группы ВПЧ-инфекция имеет транзиторный характер. Однако несмотря на низкую специфичность теста в отношении интраэпителиальных опухолей и рака, именно у женщин моложе 30 лет он может использоваться в качестве скринингового с последующим цитологическим исследованием. Чувствительность и специфичность значительно увеличиваются при комплексном использовании цитологического метода и исследования для обнаружения ВПЧ, особенно у больных с сомнительными цитологическими данными. Этот тест важен при ведении пациенток с ASC-US, при динамическом наблюдении для определения риска рецидива или прогрессирования заболевания (CIN II, СIN III, carcinoma in situ, инвазивный рак).

Возможности ранней диагностики рака шейки матки

В статье обозначены проблемы в организации профилактики рака шейки матки и обсуждается диагностический алгоритм заболеваний шейки матки: стандартизованный забор клеточного материала с шейки матки; применение жидкостной цитологии; иммуноцитохимическое исследование онкомаркера р16. Предлагается алгоритм действий врача-гинеколога.

1. Актуальность проблемы

Рак шейки матки — злокачественная опухоль, этиологическим фактором которой являются вирусы папилломы человека (HPV) серотипов № 16, 18, 33, 35 и др. Согласно Всемирной базе данных по онкологической заболеваемости — GLOBOCAN (GLOBOCAN 2002 Database Jun. 2006), частота вновь выявляемых случаев рака шейки матки составляет в Российской Федерации 16,2 на 100 тыс. населения в год, в то же время смертность от данной опухоли — 10,1 на 100 тыс. населения в год. Организация цитологического скрининга позволила существенно снизить заболеваемость и смертность от рака шейки матки. Вместе с тем сохранился ряд:

1. Отсутствие стандартизованного забора материала — неадекватно взятый материал с шейки матки приводит к ложно-негативным результатам;

2. Проблема ложноположительных цитологических заключений (когда мазок показывает дисплазию там, где ее нет на самом деле) не дискредитирует идею цитологического скрининга в целом, т.к. в большинстве случаев она разрешается ценой относительно малоинвазивных воздействий (биопсия шейки, повторная цитология после пробного лечения). Тем не менее, в каждом конкретном случае эта проблема создает ряд неудобств врачу и пациентке:

-необходимость выполнения биопсии (стоимость, инвазия, время)

-необходимость повторных визитов к врачу

-негативное психологическое воздействие на пациентку, связанное с информацией о возможности развития у нее рака

3. Даже если диагноз дисплазии верифицирован гистологически, вероятность перехода дисплазии в рак составляет менее 50% (Хансон К.П., Имянитов Е.Н. Практическая онкология 2002). Вместе с тем, как на клиническом, так и на микроскопическом уровне в настоящее время отсутствуют достоверные прогностические критерии дальнейшего биологического поведения дисплазии (Nasser SM, Cibas ES, Crum C, et al. Cancer 2003).

4. Если консенсус в лечебной тактике по отношению к тяжелой дисплазии и Са in situ уже достигнут, то при умеренной и легкой дисплазии многое зависит от мнения лечащего врача. Он должен сопоставить цитологическое заключение, клиническую и кольпоскопическую картину, возраст пациентки и т.п. и принять решение (в диапазоне от наблюдения без лечения до конусовидной эксцизии шейки матки). При этом зачастую врач стоит перед нелегким выбором, т.к. агрессивная тактика не всегда оправдана (особенно у молодых пациенток), а необоснованно выбранная выжидательная тактика грозит развитием рака. Ситуация усугубляется тем, что в этом вопросе нет ни единства во мнении среди врачей, ни определенных общепринятых стандартов (Ашрафян Л.А., Харченко Н.В., Огрызкова В.Л., Антонова И.Б. Практическая онкология 2002).

5. Проблема ложноотрицательных цитологических заключений в налаженной системе цитологического скрининга нивелируется ежегодным повторением цитологического мазка. Однако при разовом цитологическом исследовании (когда пациентка до этого не была охвачена скринингом) в некоторых случаях требуются дополнительные гарантии отсутствия неопластического процесса.

6. Особо остро проблема ложноположительных и ложноотрицательных цитологических заключений стоит в отношении клеток железистого эпителия. В то время как аденокарцинома шейки может вообще не проявляться в цитологическом мазке, причиной выраженных изменений клеток железистого эпителия (даже с цитологической картиной аденокарциномы) могут являться реактивные процессы или эндометриоз (Krane J.F., Granter S.R. Cancer 2001).

7. Среди экспертов нет единого мнения по поводу тактики в отношении пациенток, которые инфицированы штаммами HPV высокого онкогенного риска, но нет дисплазии в цитологическом мазке. Мнение о том, что требуется лечить всех носителей и контактных лиц, сегодня уже дискредитировало себя, потому что большая часть носителей никогда не заболеет раком шейки матки.

Для разрешения данных проблем предлагается следующий диагностический алгоритм заболеваний шейки матки:

1. Стандартизованный забор клеточного материала с шейки матки;

2. Применение жидкостной цитологии;

3. Иммуноцитохимическое исследование онкомаркера р16ink4α.

Каждый из перечисленных пунктов обсуждается на последующих страницах статьи.

2. Забор материала

При отсутствии видимой патологии с шейки матки обязательно берется соскоб, для цитологического исследования.

Учитывая отсутствие видимой патологии, материал берется со всей поверхности шейки матки и из шеечного канала. В связи с тем, что рак чаще всего развивается в месте соединения плоского эпителия шейки матки с цилиндрическим эпителием цервикального канала, по периметру маточного зева (так называемая зона превращения), соскоб для забора материала при скрининге должен обязательно включать эту зону и эпителий шеечного канала.

Принципиальное значение при этом имеет использование специального инструмента, гарантирующего взятие материала со всех указанных зон и обеспечивающего информативность препарата. Использование приспособленных инструментов и средств недопустимо, так как это приводит к снижению эффективности скрининга, вплоть до нулевых результатов.

3. Жидкостная цитология

Более пятидесяти лет назад доктор Папаниколау, чьим именем впоследствии был назван метод (Рар-тест), разработал метод цитологического исследования клеток цервикального канала по мазку на стекле. Рар-тест широко используется в скрининговых исследованиях для диагностики рака шейки матки, предраковых и фоновых состояний. В странах северной Европы, где хорошо организованы скрининговые исследования, лечение предопухолевых состояний и ранних форм рака позволило уменьшить смертность от инвазивной цервикальной карциномы на 50 — 70 %. По опубликованным данным, в Финляндии в 1992 г. заболеваемость была снижена до 2,8 случаев на 100000 женщин. В России в 1998 г. было выявлено 11 937 новых случаев заболевания, что составляло 15,3 на 100000 женщин, из которых 6,078 умерло (Syrjänen S., Shabalova I., Petrovichev N. et al. J Lower Genital Tract Disease 2002). В Англии по данным на 1987/88 гг. заболеваемость составляла 9 на 100000 женщин, смертность в 1997 г. — 3,7 на 100000. При этом около 4 млн. женщин в год проходили цитологическое скрининговое исследование цервикальных мазков (Payne N, Chilcott J, McGoogan E. University of Sheffield 2000.). В настоящее время выявление группы риска при цитологическом исследовании цервикальных мазков во время профилактических осмотров и дальнейшего наблюдения позволяют уловить процесс озлокачествления на самых ранних стадиях.

Необходимой предпосылкой для точной оценки морфологии клеток в мазке является правильно сделанный и хорошо окрашенный мазок. Эффективность цитологической диагностики в значительной мере определяется качеством приготовления препаратов. В настоящее время все большее распространение получает новая технология приготовления цитопрепаратов, так называемая жидкостная цитология. Важной технологической особенностью метода жидкостной цитологии (ЖЦ), улучшающей качество исследования, является то, что исследуемый материал берется в специальный стабилизирующий раствор, который обеспечивает его сохранность без разрушения и потери клеток. При этом весь клеточный материал сохраняет без изменения свои морфологические и иммуноцитохимические свойства. Для метода ЖЦ известно несколько систем: Cytospin, AutoCytePrep (CytoRich), LABONORD Easy Prep, Thin Prep.

В последние пять лет в разных странах проводилось много исследований, в которых сравнивалась эффективность традиционной техники и ЖЦ, используя для подтверждения диагнозов гистологическую экспертизу, как «золотой стандарт» и оценку цитопрепаратов согласно классификации TBS (The Bethesda System). В исследовании участвовали как поликлинические, так и стационарные отделения, обследовавшие тысячи пациентов (Grace A et al. Cytopathology 2002.). По обобщенным данным чувствительность традиционного метода колеблется в широком диапазоне значений: 34,5 — 89 %; а для метода ЖЦ имеет более стабильные значения: 71,4 — 95 %. Соответственно специфичность методов составляла: 36 — 76,9 % и 58 — 76,2 %. Авторы исследований резюмировали, что метод ЖЦ является более надежным лабораторным тестом, уменьшает количество ложноотрицательных результатов, уменьшает количество неудовлетворительных для анализа препаратов и время, необходимое цитологу для оценки препарата.

Исследование мазков по Папаниколау, полученных традиционным методом сбора материала, показывает, что не все, а только от 6,5 до 18 % взятых клеток наносятся на мазок. Кроме того, многие из этих клеток в результате плохого нанесения трудно или невозможно анализировать. Не вызывает сомнения, что традиционный метод анализа цитологического мазка имеет высокую диагностическую эффективность. Тем не менее, существует мнение, что метод имеет от 6 до 55 % ложноотрицательных результатов. По данным обзора Fahey чувствительность традиционного метода составляет 55-65 %, а специфичность — 65-70 % (Fahey MT, Irwig L, Macaskill P. American Journal of Epidemiology 1995).

Рисунок 1. Мазки полученные Г6 — традиционным способом, Р20 — при помощи жидкостной цитологии.

Причиной большинства (около 2/3) ложных результатов, снижающей качество работы лаборатории, является ошибка взятия или переноса материала для приготовления мазков. Материал для цитологического исследования получают с поверхности слизистой оболочки. Слизь, присутствующая во взятом материале, мешает перенести на мазок клетки, также материал невозможно равномерно перемешать. Материал может быть неравномерно распределен на стекле. Слишком толстый мазок является причиной получения неполноценного материала. При переносе материала на стекло традиционным способом клетки целого региона шейки матки могут не попасть в препарат. Подсушивание и потеря прилипших к инструменту клеток значительно уменьшает диагностическую информативность микропрепаратов (рис. 2). Метод ЖЦ позволяет исключить эти негативные факторы (Амелюшкина В.А. Лабораторная медицина 2002).

Рисунок 2. Мазки, полученные традиционным способом (а) и при помощи жидкостной цитологии (b).

Однако рутинное окрашивание мазков дает нам информацию о состоянии шейки матки на настоящий момент, но оно не способно оценить онкогенный потенциал изменений в тех случаях, когда не выявляется рак. Таким образом, применение только цитологического метода недостаточно для скрининга рака шейки матки.

Преимущество жидкостной цитологии состоит в том, что она из одного забора материала способна дать до 5-6 «серийных» (то есть одинаковых по клеточному составу) мазков. Это дает возможность применения дополнительных методов исследований. Длительное время таким дополнительным методом исследования применяли определения ДНК вируса папилломы человека высокого онкогенного риска. Однако в настоящее время известно, что скрининг ВПЧ инфекции, осуществленный у женщин соответствующего возраста, может идентифицировать пациенток с низким риском развития рака шейки матки в случае негативного теста, но ПЦР ВПЧ бесполезна для обнаружения пациентов с высоким риском прогрессии. Для достижения данной цели нам необходим тест, позволяющий выявлять проявление онкогенного потенциала вируса — таким образом, наше внимание должно быть перенесено от агента к хозяину. (Miller AB. Lancet 2001).

4. Иммунноцитохимическое исследование онкомаркера р16 Нормальный клеточный цикл состоит из G1, S, G2 и M фаз. Эпителий шейки матки представляет собой динамическую ткань с постоянным клеточным обновлением. Киназа, которая обеспечивает прохождение клетки из G1 в S фазу клеточного цикла — это E2F. В норме она неактивна, находясь в связанном состоянии с белком супрессором Rb (продукт гена ретинобластомы) (рис. 3).

Рисунок 3. Нормальный клеточный цикл.

Белок р16(INK4a) осуществляет контроль разобщения комплекса E2F-Rb, не допуская безудержной пролиферации клетки. Однако синтез р16(INK4a) в норме по механизму обратной связи сдерживается, таким образом, концентрация данного белка в нормальной клетке чрезвычайно мала, что проявляется негативной иммуноцитохимической реакцией (рис. 4).

Рисунок 4. Негативная реакция на р16ink4α в нормальном плоском эпителии шейки матки

Белок Е7 вируса папилломы человека ВПЧ высокого онкогенного риска при своем взаимодействии с продуктом гена ретинобластомы приводит к разобщению комплекса E2F-Rb.

Рисунок 5. Онкогенное воздействие белка Е7 на клеточный цикл, приводящее к синтезу р16 ink4α. E2F остается постоянно в активном состоянии, стимулируя безудержную пролиферации клетки. Р16(INK4a) пытается сдержать пролиферацию клетки, что приводит к бесконтрольному его синтезу (рис. 5). Однако р16 лишен своей мишени, что в условиях отсутствия обратной связи значительно повышает его концентрацию в клетке. Иммуноцитохимически это проявляется позитивной реакцией (рис. 6), что является биомаркером инициации канцерогенеза в эпителии шейки матки (Nieh S., Chen S.F., Chu T.Y. et al. Gynecol Oncol. 2003).

Рисунок 6. Позитивная реакция на р16ink4α (коричневое окрашивание ядер) в диспластически измененном эпителии шейки матки.

Было достоверно показано, что экспрессия р16 связана с низкой, умеренной и тяжелой дисплазией (с внутриэпителиальными плоскоклеточными поражениями шейки матки как высокого, так и низкого Grade, LSIL и HSIL соответственно классификации ВОЗ), причем экспрессия р16 не встречалась в плоском эпителии без признаков дисплазии (Bibbo M. et al. Acta Cytol 2002). В то же время, хотя отмечалась четкая корреляция обнаружения ДНК вируса папилломы человека с дисплазиями, имелось также большое количество ПЦР-позитивных на HPV случаев (с эписомальной локализацией HPV), в которых, при последующем гистологическом исследовании отсутствовал предрак и рак (Nieh S., Chen S.F., Chu T.Y. et al Gynecol Oncol. 2005). Данное явление подтверждалось негативной иммуноцитохимической реакцией на р16ink4α в диспластических клетках (рис. 7).

Рисунок 7. Негативная иммуноцитохимическая реакциея на р16ink4α в диспластических клетках (указано стрелкой).

Таким образом, иммуноцитохимическое определение экспрессии р16 на мазках, приготовленных при помощи жидкостной цитологии, может позволить:

1. Достоверно оценивать потенциал дисплазии в отношении развития рака шейки матки и, соответственно, выбирать более консервативную или более агрессивную тактику лечения;

2. Уточнять заключения цитолога. Дополнительному исследованию на р16, с нашей точки зрения, подлежат все случаи атипической цитологии (кроме инвазивного рака шейки матки), неопределенные цитологические заключения (атипические клетки плоского эпителия неясного значения-ASCUS) и все изменения железистого эпителия (Murphy N. , Heffron B., King B. et al. Virchows Arch 2004);

3. Разрешать спорные вопросы при выявлении гинекологом высокоаномальной кольпоскопической картины, не сопровождающейся изменениями в цитологическом мазке;

4. Во многих случаях обоснованно отказаться от биопсии;

5. У большинства пациенток пожилого возраста с цитологической картиной дисплазии на фоне атрофического цервицита обоснованно избрать выжидательную тактику, отказавшись не только от лечения, но и от биопсий, и увеличить интервалы между диспансерными осмотрами. У небольшого числа р16-позитивных пациенток этой возрастной группы, напротив, обоснованно избрать более активную тактику;

6. Определять индивидуальную тактику в отношении пациенток, инфицированных штаммами вируса папилломы человека высокого онкогенного потенциала, если у них нет цитологических и кольпоскопических изменений. У женщин с позитивной ПЦР на HPV выделить группу пациенток, у которых уже инициирован канцерогенез в эпителии шейке матки, и направить на них необходимое лечебное воздействие. Соответственно в более многочисленной группе р16 негативных женщин необходимо продолжить мониторинг;

7. Усовершенствовать мониторинг пациенток, прошедших органосохраняющее лечение по поводу «тяжелой дисплазии» или «рака in situ», добавив определение р16 к рутинному цитологическому исследованию. Это позволит у пациенток наибольшего риска повысить чувствительность цитологического исследования и тестировать персистирующую папилломавирусную инфекцию до появления морфологических изменений.

5. Алгоритм действий врача-гинеколога

1. Забор материала мы рекомендуем проводить при помощи одноразовой цервикальной щеточки (cervix-brush, рис. 8): она вводится во влагалище под контролем глаза. Конус щеточки осторожно направляется в цервикальный канал. После введения в него конуса, щеточка прижимается к поверхности шейки и производится 5 полных круговых вращений — три по часовой стрелке и два — против часовой стрелки. Перед проведением данных манипуляций необходимо тщательно очистить шейку матки от слизи. Щеточку с материалом необходимо опустить в контейнер с жидкой транспортной средой и тщательно ополоснуть ее там. Жидкая среда и клеточная среда должны храниться в холодильнике при температуре от +2 до +8 оС. Клеточная суспензия стабильна в течение 10 дней.

Рисунок 8. Цервикальная щеточка.

2. Лабораторный этап занимает от 3 до 5 дней и включает в себя центрифугирование среды с получением монослойных мазков, рутинное окрашивание по Романовскому-Гимзе, иммуноцитохимическое исследование на р16ink4a.

3.Интерпретация результатов. Заключение включает в себя два подраздела: жидкостную цитологию и иммуноцитохимическое исследование на р16ink4a. Формулировка заключения жидкостной цитологии не отличается от традиционной, однако, его интерпретация должна проводиться в зависимости от выявление онкомаркера р16ink4a. Особенно это относится к дисплазиям шейки матки.

— Если выявляется позитивная реакция на онкомаркер р16ink4a, больной должно быть предпринято хирургическое лечение в размере конизации шейки матки. Мы рекомендуем проводить данное лечение в специализированных онкологических учреждения.

— Если выявляется негативная реакция на онкомаркер р16ink4a, то проводится консервативное лечение на местах.

Л.И. Мальцева, Г.А.Раскин, Л.Н.Фаррахова, А.В.Ахметзянова, В.С.Петров, Р.Ш.Хасанов Казанская государственная медицинская академия

Казанский государственный медицинский университет

Клинический онкологический диспансер МЗ РТ

Литература: 1. Ашрафян Л.А., Харченко Н.В., Огрызкова В.Л., Антонова И.Б. Принципы лечения премикроинвазивного рака шейки матки.// Практическая онкология. — 2002. — Том 3. — С. 173-178;17

2. Хансон К.П., Имянитов Е.Н. Современные представления о канцерогенезе рака шейки матки.// Практическая онкология — 2002. — Том 3. — С. 145-155;18

3. Bibbo M., Klump W.J., DeCecco J., Kovatish A.J. Procedure for immunocytochemical detection of p16INK4A antigen in thin-layer, liquid-based specimens.// Acta Cytol. — 2002. — V.46 — P. 25-29;15

4. Cripe T.P., Haugen T.H., Turk J.P. et al. Transcriptional regulation of the human papillomavirus-16 E6-E7 promoter by a keratinocyte-dependent enhancer, and by viral E2 trans-activator and repressor gene products: implications for cervical carcinogenesis. // EMBO J. — 1987. — V. 6(12) — P.3745-3753;2

5. GLOBOCANDatabase Jun. 2006. https://www.dep.iarc.fr/globocan/globocan.htm; 3

6. Jenison S.A., Yu X.P., Valentine J.M., Galloway D.A. Characterization of human antibody-reactive epitopes encoded by human papillomavirus types 16 and 18. // J Virol. 1991 — V.65(3) — P. 1208-1218;1

7. Klaes R., Froedrich T., Spitkovsky D. et al. Overexpression of p16(INK4A) as a specific marker for dysplastic and neoplastic epithelial cells of the cervix uteri.// Int J Cancer. 2001 — V.92(2) — P.276-84;4

8. Meyer J.L., Hanlon D.W., Andersen B.T. et al. Evaluation of p16INK4a expression in ThinPrep cervical specimens with the CINtec p16INK4a assay: correlation with biopsy follow-up results.// Cancer. — 2007. — V. 111(2). — P. 83-92;20

9. Murphy N. , Heffron B., King B. et al. P16INK4A positivity in benign, premalignant and malignant cervical glandular lesions: a potential diagnostic problem.// Virchows Arch. — 2004. — V. 445 — P.610-615;12

10. Nasser S.M., Cibas E.S., Crum C. et al. The significance of the Papanicolaou smear diagnosis of low-grade squamous intraepithelial lesion cannot exclude high-grade squamous intraepithelial lesion.// Cancer. — 2003. — V.99. — P.272-276;16

11. Negri G., Egarter-Vigl E., Kasal A. et al. p16INK4A is a useful marker for the diagnosis of adenocarcinoma of the cervix uteri and its precursors.// Am J Surg Pathol. — 2003. — V. 27 — P.187-193;13

12. Nieh S., Chen S.F., Chu T.Y. et al. Expression of p16 INK4A in Papanicolaou smears containing atypical squamous cells of undetermined significance from the uterine cervix. // Gynecol Oncol. — 2003. — V.91(1) — P.201-8;5

13. Nieh S., Chen S.F., Chu T.Y. et al. Is p16(INK4A) expression more useful than human papillomavirus test to determine the outcome of atypical squamous cells of undetermined significance-categorized Pap smear? A comparative analysis using abnormal cervical smears with follow-up biopsies.// Gynecol Oncol. 2005 — V.99(3) — P.578-84;6

14. Rocco J.W., Sidransky D. p16(MTS-1/CDKN2/INK4a) in cancer progression.// Exp Cell Res. — 2001. — V.264 — P.42-55; 7

15. Ronco G., Cuzick J., Pierotti P. et al. Accuracy of liquid based versus conventional cytology: overall results of new technologies for cervical cancer screening: randomised controlled trial. BMJ. — 2007. — V. 335(7609). — P. 28 — 38;19

16. Sano T., Oyama T., Kashiwabara K., Fukuda T., Nakajima T. Immunohistochemical overexpression of p16 protein associated with intact retinoblastoma protein expression in cervical cancer and cervical intraepithelial neoplasia.// Pathol Int. — 1998. — V.48 — P.580-5;8

17. Ylitalo N., Josefsson A., Melbye M. et al. A Prospective Study Showing Long-Term Infection with Human Papillomavirus 16 before the Development of Cervical Carcinoma in situ. // Cancer Research. — 2000. — V. 60 — P. 6027-6032;14